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青蓮客戶又喜提高分文章啦! 2020年10月5日，中科院微生物研究所劉俊課題組在Molecular Plant雜志（IF：12.084）上在線發表了題為“A plant lectin receptor-like kinase phosphorylates the bacterial effector AvrPtoB to dampen its virulence in Arabidopsis”的研究論文。研究報道了擬南芥凝集素受體激酶LecRK-IX.2可以與丁香假單胞菌（ Pseudomonas syringae ）效應蛋白AvrPtoB相互作用并使其磷酸化，來削弱該效應蛋白的毒性，從而增強植物免疫。很榮幸，青蓮百奧技術支持了文章中磷酸化肽段的LC-MS/MS檢測工作。下面小編來給大家分享一下該文章。
研究背景
隨著植物不斷暴露于各種病原體中，在進化過程中獲得了一套有效的先天免疫系統以應對病原體的侵染。細胞膜上的模式識別受體（PRRs）可以識別病原體保守的特征物質，如細菌的鞭毛蛋白、伸長因子和真菌的幾丁質等，從而激活植物免疫。多種病原體可以分泌效應蛋白進入植物體內，干擾PRRs對病原體的識別或其介導的免疫激活通路，促進病菌致病性。效應蛋白通過多種方式干擾PRRs的功能，如阻止其磷酸化下游信號通路組分，或直接降解PRRs等。因此，病原體的效應蛋白的功能目前認為是主要干擾寄主抗性的。
樣本選擇
擬南芥Lecrk-IX.2和△avrPtoB突變菌株
研究結果
LecRK-IX.2可在S335位點磷酸化AvrPtoB
研究人員采用LC-MS/MS技術對LecRK-IX.2磷酸化的AvrPtoB進行了分析。MS結果顯示，位于40個氨基酸的肽段中S335位點的磷酸化覆蓋了AvrPtoB磷酸化的 96％（圖1B），這表明AvrPtoB S335可能是LecRK-IX.2磷酸化的殘基。為了證實這一發現，研究人員使用AvrPtoBS335A作為LecRK-IX.2的底物進行了體外激酶測定（S335被取代為丙氨酸）。因為先前的研究顯示AvrPtoB T450被Pto和Fen磷酸化，所以該研究使用AvrPtoB T450A作為對照。研究發現，LecRK-IX.2可有效地磷酸化AvrPtoB，但無法磷酸化AvrPtoBS335A（圖1C）。值得注意的是，LecRK-IX.2仍可以將AvrPtoBT450A磷酸化。這些結果表明，LecRK-IX.2介導的AvrPtoB在S335位點的磷酸化是特異性的，并且S335是一個被宿主蛋白磷酸化的新位點。
圖1. LecRK-IX.2在S335位點磷酸化AvrPtoB
S335位點的磷酸化可抑制AvrPtoB的毒性
生化數據表明LecRK-IX.2使AvrPtoB磷酸化可能破壞其毒性。為了證實這一推測，研究人員首先檢查了AvrPtoB及其突變體的細菌分泌以及研究擬南芥中這些蛋白質的亞細胞定位。結果顯示在S335處AvrPtoB的磷酸化不干擾細菌分泌或其在植物中的亞細胞定位。進一步分析表明AvrPtoB的磷酸化削弱了其對擬南芥中PTI的抑制作用。研究人員評估了AvrPtoB磷酸化對植物細菌生長的影響。生長曲線分析顯示，Pst（?avrPtoB）和Pst（avrPtoBS335D）表現出相似的毒性。與PTI響應一致，Pst（avrPtoBS335D）感染產生的細菌滴度比Pst、Pst（avrPtoBWT）或Pst（avrPtoBS335A）感染產生的細菌滴度低得多。這些結果表明，在S335位點AvrPtoB的磷酸化減弱了其毒性。
圖2. S335位點AvrPtoB的磷酸化會削弱其毒性
flg22可增強LecRK-IX.2對AvrPtoB的磷酸化
該團隊先前報道了flg22可以在數小時內誘導LecRK-IX.2表達，而LecRKIX.2/IX.1參與flg22誘導的PTI。因此，假設flg22可以增強AvrPtoB磷酸化。為了證實該結果，研究人員首先檢查了flg22處理后AvrPtoB S335位點的磷酸化。不出所料，AvrPtoB S335位點在Col-0中被磷酸化，而flg22處理增加了磷酸化水平；但是，flg22誘導的AvrPtoB S335位點磷酸化很大程度上取決于LecRK-IX.2/IX.1。接下來，檢查了LecRK-IX.2對flg22處理的早期反應，發現flg22可能在幾分鐘內就上調了LecRK-IX.2的表達，表明LecRK-IX.2是PTI中的早期反應基因。
圖3. flg22通過LecRK-IX.2促進S335位點的AvrPtoB磷酸化
結論
總之，該研究揭示了一種新的機制，通過該機制，植物LecRK蛋白LecRK-IX.2在S335位點處磷酸化了細菌效應因子AvrPtoB，從而潛在地降低了其毒性。該策略可能被植物RLKs廣泛采用，在PTI響應過程中病原體效應因子會靶向該植物。這項工作實質上提高了我們對PTI激活的認識。此外該研究還注意到，存在去除植物中AvrPtoB S335位點磷酸化的機制。這可能是為什么植物中只有一定量的AvrPtoB被磷酸化的原因。結果表明，在病原體感染期間，AvrPtoB毒性僅部分降低。
植物凝集素受體樣激酶磷酸化細菌效應子AvrPtoB以抑制其在擬南芥中的毒性
期刊名稱：Molecular Plant
IF：12.084
樣本選擇：擬南芥Lecrk-IX.2和△avrPtoB突變菌株
技術策略：磷酸化位點鑒定（LC-MS/MS）
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