好消息，青蓮客戶又喜提高分文章啦! 近日，Medicinal Chemistry雜志收錄了中國醫學科學院&北京協和醫學院藥物研究所宋丹青導師和汪燕翔導師合作的題為“Berberine Directly Targets the NEK7 Protein to Block the NEK7?NLRP3 Interaction and Exert Anti-inflammatory Activity”的研究論文。該項研究首次證明NEK7是BBR治療炎癥相關疾病(如2型糖尿病、動脈粥樣硬化、非酒精性脂肪肝和神經退行性疾病)的主要直接靶點之一。在這次發現過程中，小青展示出了相當“硬核”的朊實力呦，擔任了文章中LC-MS/MS檢測工作。我們一起來看看吧！

1.評估BBR對IL-1β分泌的抑制作用

建立LPS（含有Nigericin）處理PMA-THP-1（人單核細胞系-1）細胞促進其分泌IL-1β模型。通過Western印跡和酶聯免疫吸附試驗（ELISA）分析了上清液和裂解液中BBR對Caspase-1裂解和IL-1β分泌的時間和劑量依賴性抑制作用（圖1：a/b/c/d），結果顯示：BBR對IL-1β的分泌表現出中度抑制作用（在BMDM中），IC50值為5.1μM（圖1：e），并且在濃度高達40 μM時，未觀察到細胞死亡或凋亡（圖1f-h），表明BBR的抑制作用與細胞毒性無關。

圖1  BBR對PMA-THP-1X細胞中IL-1β分泌的抑制作用

2.直接靶蛋白的篩選與鑒定

文章選用了Compound-8d和Compound-15d分別作為陽性/陰性探針，進行蛋白質組靶向篩選，驗證BBR對IL-1β的作用。通過LC-MS/MS分析鑒定的得到了75個蛋白質，其中有10個是酶，其余的是核糖體蛋白、剪接體、微管蛋白等。與15d處理相比，8d處理在25-37 kDa之間檢測到一條明顯的條帶(圖2：c)，通過鏈霉親和素珠富集和免疫印跡實驗進一步證實分化條帶為NEK7蛋白(圖2：g)。并且驗證了8d與重組蛋白NEK7的特異性結合，也發現NEK7也能被BBR競爭性抑制(圖2：f/h)。如圖2J所示，BBR對NEK7激酶有中度抑制作用，IC50值為4.2μM，與先前對IL-1β釋放的IC50結果一致。在SPR分析中，BBR還與固定化的NEK7呈現劑量依賴性結合，Kd值為15.6μM(圖2：k)。

圖2  蛋白質靶向BBR標記

3.NEK7與?NLRP3相互作用中的BBR機制

通過免疫共沉淀(Co-IP)實驗檢測了BBR對NEK7和NLRP3之間相互作用的影響。NEK7的R121殘基正好位于NEK7和NLRP3之間相互作用的關鍵區域之一，如圖3：a所示，在293細胞中，BBR劑量依賴性地抑制了NEK7-NLRP3的相互作用，這在PMA-THP-1細胞中通過內源性Co-IP分析進一步顯示（圖3：b）。相反，沒有亞甲二氧基的O-BBR不能阻斷NEK7-NLRP3的相互作用(圖3：c)，BBR未能抑制它們之間的相互作用，而在293細胞中，121-精氨酸被突變為丙氨酸(圖3：d)。R121-A的單點突變可以極大地限制了NEK7與NLRP3之間的相互作用，從而抑制NLRP3炎癥小體的活化以及隨后一系列包括IL-1β在內的炎癥因子的釋放。

圖3  BBR阻斷NEK7和NLRP3的相互作用

4.BBR抑制NEK7的體內驗證

為了驗證NEK7作為體內BBR對抗炎癥的靶標，作者建立了NEK7敲除小鼠模型以評估BBR對IL-1β產生的影響。試驗通過用腺病毒AdV轉染小鼠10d后，每隔12h給予BBR治療3次，然后LPS刺激。結果發現，小鼠經靜脈內注射Adv shNEK7感染10天后，與對照組相比，NEK7的表達明顯降低（圖4：b）；BBR明顯減少了對照組的IL-1β產生（圖4：c），而NEK7基因未見明顯變化。用BBR治療的基因敲除組，表明BBR對IL-1β的NEK7依賴性作用。這些結果表明，由于NEK7抑制與其他機制協同作用，BBR發揮了體內作用。

圖4   BBR在體內通過NEK7抑制IL-1β