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        蛋白質組學

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        北京蛋白質組學——蛋白質組學FAQ→蛋白產品相關問題(四)

        2022-05-20 14:25:53

        蛋白質組學(英語:proteomics,又譯作蛋白質體學),是以蛋白質組為研究對象,研究細胞、組織或生物體蛋白質組成及其變化規律的科學。這個概念早是在1994年,由Marc Wikins首先提出的新名詞。

        上次分享了蛋白產品相關問題(三),本周二北京蛋白質組學將分享蛋白產品相關問題(四)~

        現在小編將帶您進入今日主題

        16. 通過 iTRAQ/TMT 實驗篩選到的差異蛋白,如何挑選驗證?

        答案:大規模的組學數據需要后期具體的驗證實驗,以支持組學數據和結論的可信度、說服力,也可以進一步提供文章發表的檔次??梢詮娜缦聨讉€方面進行選擇:

        a) 研究相關的文獻報道,已知與該研究課題密切相關的蛋白質進行進一步的研究;

        b) 優先挑選蛋白質組學定量差異倍數較大的蛋白進行研究;

        c) 挑選鑒定到的差異蛋白中unique peptide 數量相對多的蛋白進行研究(unique peptide 數量越多,可信度越高)、

        d) 挑選組間平行性好的,表達趨勢一致的蛋白進行進一步研究(趨勢越一致,說明蛋白變化越可信)



        北京蛋白質組學



        e) 結合功能分析或通路分析(生物信息學的分析范疇),篩選得到的有意義的蛋白進行研究

        17. 通過iTRAQ/TMT 實驗篩選到的差異蛋白,如何進行進一步的驗證?

        答案:驗證方法很多,如Western blot、ELISA 、PRM(平行反應監測),該方法是基于靶向的蛋白質組學,研究特定蛋白的表達變化。也可以用代謝組學,基因組學等多組學互相驗證。

        18. 通過 iTRAQ/TMT 實驗篩選到的差異蛋白,為什么后續驗證不出來?

        答案:可以從以下幾個方面考慮:

        A、選擇驗證的目標是否合理, 實驗是否具有重復性和可靠性;

        B、蛋白修飾水平的驗證是否具有時效性;

        不同階段如基因水平到蛋白質水平的驗證可能會有表達差異;大規模數據的篩選會存在一定的假陽性。

        19. 為什么通過 Elisa、WB 能檢測到的蛋白在 iTRAQ/TMT 或蛋白鑒定實驗中沒有檢測到?

        答案:western blot檢測是將目的蛋白質信號放大很多級之后進行檢測的,靈敏度很高,(除非特異性結合之外)專一性強,特異性檢測目標蛋白,幾乎不受復雜樣品中背景蛋白質豐度的影響。對于純蛋白質樣品,質譜檢測的靈敏度達fmol 水平。但在復雜樣品中,質譜不是專一性檢測的,而是選擇樣品中豐度較高的蛋白質優先檢測,而豐度較低的蛋白質則因為肽段信號過弱被淹沒而不能被檢測到。因此,如果樣品中待檢測的目標蛋白質豐度較低(或者蛋白質分子量較?。?,即使 WB 能夠檢測到,質譜并不一定能檢測到。

        20. 為什么DIA無需進行高豐度去除、無需分級?

        答案:DIA是一種全掃描技術,是將質譜整個全掃描范圍分為若干個窗口,高速、循環地對每個窗口中所有離子進行選擇、碎裂及檢測,從而無遺漏、無差異地獲得樣本中所有離子的全部碎片信息。因此DIA在獲得更高覆蓋度信息的前提下,還盡可能減少高豐度蛋白對質譜掃描的影響。


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