北京多組學聯合分析帶你了解腸道微生物組學解析糖尿病不同階段特征|宏基因組+宏蛋白組

背景

腸道微生物群在調節宿主代謝中起著重要作用。健康人和T2D和糖尿病前期患者的腸道微生物群存在差異。關于與T2D發病和進展相關的腸道微生物種類的詳細信息仍然有限，且抗糖尿病藥物等因素阻礙了疾病發展過程中腸道微生物變化的識別。

目的

作者在此利用宏基因組學和宏蛋白質組學兩種技術手段，對糖耐量正常個體（NGT，n=97）、糖尿病前期患者（Pre-DM，n=80）和未經治療的2型糖尿病患者（TN-T2D）的糞便樣本進行分析，研究糖尿病前期和治療初期T2D個體腸道微生物群的組成和功能變化以及微生物和宿主蛋白質的糞便含量，以闡明不同疾病階段的宿主與微生物相互作用關系。

研究結果

一、中國糖尿病前期和2型糖尿病患者的不同宏基因組圖譜 

使用BGISEQ-500平臺對254份糞便DNA樣本進行鳥槍式宏基因組測序，未發現NGT、Pre-DM和TN-T2D個體之間基于微生物基因的豐富度、α多樣性和β多樣性存在顯著差異。接下來使用宏基因組關聯分析（Metagenome-wide association analysis，MWAS），確定了266015個T2D相關基因（KW檢驗，p<0.05），并將這些基因聚類為126個宏基因組連鎖群（Metagenomic linkage groups，簡稱MLGs）。進一步應用KW檢驗來檢測NGT，Pre-DM和TN-T2D個體之間MLGs在相對豐度上是否有統計學差異：與NGT個體相比，Pre-DM或TN-T2D個體中來自梭狀芽胞桿菌類的MLG豐度明顯較低（圖2A）；與NGT和TN-T2D個體相比，Pre-DM中產生丁酸鹽的普拉梭菌豐度較低（圖2A）。相反地，與NGT相比，注釋到大腸桿菌、唾液鏈球菌與伊格爾茲氏菌的MLGs在Pre-DM中具有很高的豐度（圖2A）。緊接著，這些重要的發現，作者利用94例來自上海的TN-T2D患者的糞便樣本進行宏基因組測序結果在隊列中得到了驗證。

為了評估MLG在T2D中的辨別力，并確定區分不同疾病階段的關鍵MLG個體，作者構建了隨機森林（RF）分類模型，RF模型在兩個不同疾病階段的樣本分類方面表現良好，ROC曲線下面積（AUC）值從0.90到0.94（圖2B）。除了未分類的MLGs以外，用于區分TN-T2D和NGT的辨別力的MLG是粘液曲霉（Akkermansia muciniphila），對prausnitzii和大腸桿菌進行注釋的MLG在將DM前期樣品與TN-T2D和NGT樣品分離方面都顯示出重要作用（圖2C），這表明prausnitzii F.豐度較低，而大腸桿菌在Pre-DM個體中有豐度較高的獨特微生物DNA特征。

KEGG富集表明NGT、Pre-DM和TN-T2D個體中微生物功能可能存在差異模式，與NGT個體相比，Pre-DM腸道菌群中多種模塊富集，包括糖磷酸轉移酶系統（PTS），氨基酸ABC轉運蛋白和細菌分泌系統等（圖2D）。TN-T2D中也具有類似富集；此外，與NGT和TN-T2D個體相比，Pre-DM個體在幾種能量和核苷酸代謝模塊方面表現出顯著降低（圖2D）。通過排除大腸桿菌基因，進行二輪KEGG富集分析，發現多種Pre-DM富集的模塊在Pre-DM和NGT個體之間無顯著差異，這表明大腸桿菌可能是Pre-DM相比于NGT功能差異的重要貢獻者。綜上所述，這些結果表明，在糖尿病前期，與疾病相關的腸道微生物組成和功能可能發生重大變化。 

二、腸道宏蛋白質組學同時確定糞便中微生物和人類蛋白質的水平 

使用基于質譜的iTraq標記蛋白質組學對84例樣本糞便進行研究，共鑒定出15670個蛋白質，包括15245（百分之97.29）個微生物蛋白質和425（百分之2.71）個人類蛋白質。一種微生物肽通常與多個具有高度序列相似性的蛋白質相匹配，導致難以識別單個肽的微生物來源，進行蛋白質去冗余后共11980個非冗余蛋白質，這些獨特肽的相對強度進一步用于元蛋白定量。比較發現三組之間僅共享2782個蛋白，表明各組之間蛋白質水平上的微生物表達模式不同。與其他組相比，分類學注釋表明Pre-DM個體中獨特的變形桿菌蛋白的比例更高。

三、宏基因組和宏蛋白質組之間微生物群特征的一致性和不一致性

接下來在DNA和蛋白質水平上研究了微生物組成和功能的一致性以及差異。門水平上90％以上的基因和蛋白始終被分配到厚壁菌門，擬桿菌門和變形桿菌門?？傮w有一致性，但擬桿菌門具有更高的蛋白注釋比例（百分之41），而基因注釋比例為（百分之25）（圖3A），這表明在84個樣本中，擬桿菌可能表現出比其他門更高的蛋白質產量。屬水平上，宏蛋白質組81個屬，而宏基因組鑒定到212個屬。隨后進行了Spearman秩相關分析，以確定基于宏基因組學的宏蛋白數量與屬級豐度之間的關系，擬桿菌屬、普氏菌屬、普拉梭菌屬包含大部分的宏蛋白（圖3B）。

比較基于宏基因組學和宏蛋白質組學數據的KEGG功能類別，觀察到兩個數據集之間單個類別的相對貢獻存在很大差異（圖3C），百分之24和百分之18的蛋白質被分配到碳水化合物代謝和翻譯類別，而這兩個類別的相應宏基因組百分比分別只有百分之11和百分之4（圖3C）。1508個蛋白可歸屬于10個KEGG直系同源物（KO），主要為Ca激活的氯離子通道(K07114)、持家蛋白（K02355，K02358和K02395）等（圖3C）。變形菌門宏蛋白質（主要來自大腸埃希氏菌，檸檬酸桿菌和腸桿菌）在Pre-DM顯示增加的趨勢，而擬桿菌屬的宏蛋白傾向于在TN-T2D富集（圖3D）, 與Pre-DM和TN-T2D相比，在NGT中參與碳水化合物糖代謝的宏蛋白水平較低（圖3E）。

四、T2D患者糞便中人類排泄蛋白的功能特征 

在檢測到的425種人類蛋白質中，確定了218種在NGT、前DM和TN-T2D組之間共享的人類蛋白質。接下來，我們用基因本體（GO）術語對人類蛋白質進行注釋，包括幾種腸粘蛋白以及膜聯蛋白的成員。233種人類糞便蛋白質具有組織特異性注釋，151種蛋白質在消化系統中表現出高表達，其余蛋白質被注釋為在血液或其他組織（如表皮）中高表達。

發現糞便中存在的49種人類蛋白質在至少兩組之間表現出較高或較低強度的趨勢（圖4A）。據報道可克制變形桿菌門中幾種生物體生長的抗菌組織蛋白酶G的水平在Pre-DM樣本中往往高于NGT和TN-T2D，這與組織蛋白酶G的已知克制劑α-1-抗胰蛋白酶和α-1-抗胰蛋白酶的水平較低有關（圖4A），這表明糖尿病前期患者可能已經開始采取策略，激活防御系統，對抗大腸桿菌相對豐度的增加。網絡分析顯示，在NGT、前DM和TN-T2D個體之間的兩兩比較中，20種人類蛋白質之間的相關性顯示出與富集相關的不同趨勢（圖4B）。

為了研究人類腸道中可能存在的宿主-微生物-蛋白質相互作用，接下來將研究區分性細菌和人類蛋白質之間可能存在的相關性。發現Pre-DM富集的大腸桿菌蛋白質與參與先天免疫反應和粘附的人類蛋白質之間存在顯著的負相關，而大腸桿菌蛋白質與組織蛋白酶G、細胞色素c（CYC）和胰蛋白酶之間存在正相關（圖4C）。

結論

本研究在宏基因組學和宏蛋白質組學水平上揭示了大量Pre-DM相關特征。與NGT相比，Pre-DM和TN-T2D中幾種產丁酸菌的相對豐度較低。腸桿菌科物種豐度較高（以大腸桿菌為主），宿主蛋白水平較低，可能參與糖尿病前期蛋白細菌特異性反應。宏蛋白質組學不僅為估計微生物蛋白質的表達提供了有價值的補充，而且也為描述不同疾病階段的宿主-微生物蛋白質相互作用提供了有價值的補充，TN-T2D和Pre-DM個體相比，NGT個體中幾種宿主源性AMP水平更高的趨勢，這表明NGT個體中可能有更強的宿主防御入侵（疾病相關）微生物的能力。糖尿病前期患者在過渡到T2D之前，腸道生態系統可能存在獨特的非線性變化。

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